Robert Vaughn is de zoon van Walter Vaughn en Broadway-ster Marcella Gandel. Hij groeide op in Minneapolis, studeerde er journalistiek en besloot hierna om acteur te worden. In 1951 nam Vaughn deel aan een studenten-hoorspelwedstrijd die werd georganiseerd door Philip Morris. Hij haalde de finale, ging hierna dramaturgie studeren aan het Los Angeles City College en behaalde een bachelor-diploma voor toneel. Hij passeerde het kandidaatsexamen, vervolgde zijn studie met het doctoraatsexamen en werkte ook met vrucht zijn studies politicologie af.

Hij kreeg een job bij het Summer House Theatre van Albuquerque en werd er meteen eerste acteur en de vaste regisseur. Tijdens de productie van End as a Man kreeg hij van Hecht-Lancaster Productions zijn eerste filmrol aangeboden in Hell’s Crossroads. De kers op de spreekwoordelijke taart kwam er toen hij voor zijn rol in de film The Young Philadelphians als Chester Gwynn, een erfgenaam die door oplichting zijn erfenis verliest, genomineerd werd voor een Oscar. Vaughn was ook één van de Magnificent Seven maar zijn carrière kreeg een extra boost met de televisieserie The Man from U.N.C.L.E. waarin hij de rol van de ijskoude spion Napoleon Solo vertolkte.

Zeker ook het vermelden waard is zijn rol in Bullit waar hij de rol van de openbare aanklager die het aan de stok krijgt met de held Steve McQueen voor zijn rekening nam. In Clay Pigeon speelde hij dan weer de rol van slechterik. Vaughn is ook te zien geweest in een aantal spionagefilms, zowel op het grote witte doek als op televisie.

Robert Vaughn was ook actief op vlak van politiek, als liberaal. In 1972 schreef hij Only Victims, een gedetailleerde reconstructie van de zuivering die men in Hollywood wou doorvoeren als gevolg van het onderzoek van het House Un-American Activities Committee.