Na de nederlaag van hun oude aartsvijand, The Shredder, zijn de Turtles niet meer het hechte blok dat ze geweest zijn. Hun sensei, de rat Splinter (Mako), doet er echter alles aan om hen samen te houden maar gaat zich toch zorgen maken. Er beginnen immers vreemd dingen te gebeuren in New York City. Tech-industrieel Maximillian J. Winters (Patrick Stewart) brengt een leger van oude monsters op de been en slechts één super-ninja gevechtsteam kan hen tot staan brengen : Leonardo (James Arnold Taylor), Michelangelo (Mikey Kelley), Donatello (Mitchell Whitfield) en Raphael (Nolan North)! Met de hulp van hun oude bondgenoten April O?Neil (Sarah Michelle Gellar) en Casey Jones (Chris Evans), maken de Turtles zich op voor het gevecht van hun leven, als ze eens te meer oog in oog komen te staan met de mysterieuze Foot Clan, waarvan de leden hun eigen ninja-vaardigheden ter beschikking hebben gesteld van de onderneming van Winters.
De film is helemaal tot stand gekomen via geavanceerde CG-animatie, met de Teenage Mutant Ninja Turtles in een volledig nieuwe, 21ste-eeuwse look.