Hij was pas zes maand toen de ganse familie Fonda verhuisde van de omgeving van New York naar Omaha waar zijn vader een drukkerij opstartte. Henry Fonda had de bedoeling om voor een krant te gaan schrijven en ging zich precies daarom inschrijven aan de Universiteit van Minnesota afdeling journalistiek. Na twee jaar hield hij het voor bekeken en werd loopjongen bij een kredietmaatschappij.

In 1925 kreeg hij de vraag van een familiekennis - de moeder van de toen 1-jarige Marlon Brando (!) - om de hoofdrol te vertolken in een amateurtoneelstuk dat in première zou gaan in de Shouwburg van Omaha. Henry Fonda gaf zijn baan op en bleef drie jaar verbonden aan het plaatselijke toneelgezelschap. Met als extra vergoeding een klein salaris omdat hij tevens de assistent was van de Directeur. In 1928 kwam hij in contact met een groep beginnende toneelspelers die tijdens hun zomervakantie hun eigen toneelvereniging wilden opstarten.  Toenmalige groepsleden: Joshua Logan en Myron McCormick, in een latere fase kwamen daar onder andere Margaret Sullavan, Mildred Natwick en James Stewart bij.

Bij de University Players vetolkte hij hoofdrollen in stukken waarin Margaret Sullavan ook te zien was. Dat zou overigens in 1931 zijn eerste echtgenote worden (er volgden later nog vier huwelijken!) maar niet voor lang, het paar scheidde al in 1933. We schrijven 1934 als Fonda een belangrijke rol op Broadway te pakken had (hij maakte zijn Broadway-debuut al in 1929) in een eerste versie van New Faces, gevolgd door een rol in The Farmer Takes a Wife. Het jaar daarna al trok hij naar Hollywood waar hij de rol speelde in de filmversie. Daar deelde hij een tijd een appartement met James Stewart, nog een opkomende ster in die tijd.

Belangrijke rollen in deze beginperiode waren die (als John Fords eerste keuze) in Young Mr. Lincoln waar hij een rol van de stereotiepe Amerikaanse held neerzette. Maar ook die In The Grapes of Wrath waar hij de rol vertolkte van de man in de straat die opkomt en zich verzet tégen de onderdrukking. Eerlijkheid en integriteit waren belangrijke elementen voor Henry Fonda in het kiezen van zijn filmrollen, bijvoorbeeld die van Sheriff, Presidentskandidaat, jurylid, enz...

Het komedie-filmgenre was hij dan weer minder genegen: zijn rol van slangenexpert in The Lady Eve met onder meer Barbara Stanwyck was hier een uitzondering op, andere komedies: The Male Animal en The Magnificent Dope. Een ook al bijzonder zijsprongetje was toen hij de rol van inslechte moordenaar vertolkte in C'era una volta il West, beter bekend als Once Upon a Time in the West.

In 1936 trouwde Henry Fonda met Frances Seymour Brokaw, uit hun huwelijk ontsproten zoals dat dan heet twee kinderen: Jane en Peter Fonda die in de jaren '60 ook al twee filmsterren werden. En het acteren werd zelfs nog een generatie verder gezet: Bridget Fonda, dochter van Peter Fonda werd ook actrice. Het huwelijk tussen Fonda en Brokaw kende een dramatisch einde toen ze in 1950 zelfmoord pleegde in de instelling waar ze verbleef na een zenuwinzinking. 
In 1950 trouwde Fonda met Susan Blanchard, ze kregen één kind, Amy, en scheidden in 1956. In 1957 gaf de acteur voor de vierde keer zijn ja-woord, deze keer aan Alfreda Franchetti, in 1962 werd het huwelijk ontbonden. In 1965 volgde dan huwelijk vijf, meteen ook het laatste. De gelukkige was Shirlee Adams, een gewezen stewardess in de luchtvaart.

In 1942 sloot Fonda zich aan bij de Amerikaanse Marine en werd uitgestuurd naar de Stille Oceaan. Als Luitenant kreeg hij een Bronze Star én een Presidentiële onderscheiding.

Toen hij na de oorlog naar Hollywood terugkeerde beïnvloedden zijn ervaringen in het leger overduidelijk de keuze van zijn filmrollen: My Darling Clementine van John Ford, Fort Apache en natuurlijk The Long Night van Anatole Litvak.

Zijn grootste succes op de toneelplanken kwam er in 1948 toen hij in New York gedurende drie jaar de titelrol vertolkte in het Broadway-stuk Mister Roberts. Hij deed het overigens ook nog eens over in de filmversie van het toneelstuk. Een ander belangrijk theaterstuk uit die periode was natuurlijk The Caine Mutiny Court-Martial.

Vanaf de jaren '50 was Fonda zowel in toneelstukken te zien als in langspeelfilms, tot grote tevredenheid van zijn fans overigens. Maar ook op televisie kon je de acteur zien, zoals in The Deputy bijvoorbeeld, een televisieserie die te zien was van 1959 tot 1961. Of in de tv-serie The Smith Family (1971-1972). Maar ook in televisiefilms: The Red Pony en Clarence Darrow bijvoorbeeld.

In 1978 kreeg Henry Fonda de prestigieuze Life Achievement Award van het American Film Institute.

In 1981, slechts enkele maanden voor zijn dood, kreeg Fonda een Academy Award/Oscar voor zijn rol van onverzorgde, slonzige tachtiger in On Golden Pond, tijdens de opnames was Fonda overigens al ernstig ziek. Nog tijdens de opnames van de film (1980) had hij al een ere-Academy Award gekregen bij wijze van eerbetoon aan zijn kunnen en carrière.