Agnes Moorehead, dochter van een Presbyteriaanse pastoor (ooit beweerde de actrice zelf dat ze elk woord in de bijbel voor waar aannam), studeerde aan het Muskingham College, de Amerikaanse Academy of Dramatic Art, de Universiteit van Wisconsin en de Bradley Universiteit waar ze onderscheiden werd met een doctoraat in de literatuur. Na haar studies gaf ze een tijd toneelles op de middelbare school.

Ze was pas drie toen ze voor het eerst te zien was in een toneelstuk en maakte haar professioneel debuut op 11-jarige leeftijd in het ballet en het koor van de St. Louis Opera.

Als tiener was haar zangtalent regelmatig te horen op de lokale radio.  

In 1928 was ze te zien op Broadway, zij het in kleinere rollen waarna ze al snel terugkeerde naar de radio en er te horen was in de stukken March of Time als imitator van Eleanor Roosevelt maar ook in Cavalcade of America.

Tussen 1933 en 1936 tourde Agnes Moorehead in Vaudeville-vorm samen met Phil Baker.

In 1940 kwam haar carrière in een soort van stroomversnelling toen ze aan de slag ging bij Orson Welles’ Mercury Theatre Company.

Moorehead maakte haar filmdebuut als Kanes moeder in Citizen Kane en was te zien in nog een aantal andere films van Welles. Het jaar na Citizen Kane kreeg ze van de New York Film Critics de Prijs voor Beste actrice en werd ze voor het eerst genomineerd voor een Academy Award/Oscar voor haar rol van oude vrijster in Orson Welles’ The Magnificent Ambersons. Moorehead was te zien in het toneelstuk Sorry, Wrong Number maar werd gepasseerd door Barbara Stanwyck bij de verfilming ervan.

Begin de jaren '50 ging ze op tournee in Europa en de Verenigde Staten. Samen met Charles Boyer, Charles Laughton en Sir Cedric Hardiwicke verzorgde ze lezingen van Shaws stuk Don Juan in Hell.
In 1954 ging ze op tournee met haar eigen soloshow The Fabulous Redhead die ze daarna met tussenpozen speelde in meer dan 200 steden overal ter wereld.

Ondanks haar succesvolle filmcarrière bleef ze ook actief op vlak van toneel en televisie.  Zo was ze op tv van 1964 tot 1972 te zien in Bewitched in de rol van Endora, een chagrijnige schoonmoeder/moederheks.In 2005 werd er een film uitgebracht met dezelfde titel, gebaseerd op de gelijknamige tv-serie. Daarin besteedde men maximaal aandacht aan de manier waarop Endora werd voorgesteld. Met de passende kledij wilde men zorgen voor een eerbetoon aan de actrice.

Moorehead was een lesbienne en werd door acteur Paul Lynde ooit omschreven als "classy as hell, but one of the all-time Hollywood dykes".
Agnes Moorehead is twee keer getrouwd geweest met een acteur; van 1930 tot 1952 met John Griffith Lee (het paar kreeg samen één kind, Sean) en van 1953 tot 12 maart 1958 met Robert Gist.
Toen ze haar eerste echtgenoot in bed betrapte met een andere vrouw zou ze naar verluidt geroepen hebben dat, als hij minnaressen kon hebben, zij dat ook kon!...

Nadat ze in 1973 25 weken lang te zien was geweest in het stuk Gigi en begon aan een nieuwe reeks ervan in New York, overleed ze na de eerste voorstelling aan een longaandoening. Eén bron vermeldt een longontsteking als oorzaak, een ander houdt het op longkanker. Indien het laatste klopt werd zij net als John Wayne, Lee Van Cleef, Pedro Armendariz en Susan Hayward geconfronteerd met kanker, opmerkelijk als je weet dat die stuk voor stuk in één en dezelfde film te zien waren: The Conqueror (1956).