Zijn moeder was bezeten van film, zijn vader een toneelknecht en later meubelontwerper. Dustin zelf studeerde aan het Los Angeles Conservatory Theatre of Music en het Santa Monica City College tot hij het daar voor bekeken hield om concertpianist te worden. Zijn toneelopleiding kreeg hij bij het Pasadena Playhouse waar ook Gene Hackman les volgde en bij Lee Strasberg in New York. Ondanks zijn opleiding en talent kwam hij in het begin van zijn carrière nauwelijks aan de bak met toneel- en televisiewerk waardoor hij een tijd als conciërge en ook een korte periode in een ziekenhuis werkte. Het tij leek te keren wanneer hij voor zijn toneelrol in The Journey of the Fifth Horse een Obie Award won. Zijn echte toneeldebuut had hij al gemaakt in de Sarah Lawrence College productie van Gertrude Stein’s Yes Is For A Very Young Man, we laten zijn klein figurantenrolletje in het Broadway-stuk A Cook for Mr. General van 1961 even buiten beschouwing. Voor zijn rol in Harry, Noon and Night won hij een Obie Award en een Drama Desk Award.
En toen kwam alles in een stroomversnelling nadat regisseur Mike Nichols hem aan het werk zag in de farce Eh? (bekroond met een Theatre World- en Drama Desk Award) en hem een rol aanbood in The Graduate. Dat was niet de eerste film met Hoffman, maanden voor The Graduate speelde hij al in een low budget Spaans-Italiaanse coproductie Un dollaro per 7 vigliacchi die de Amerikaanse titel Madigan’s Millions meekreeg. Die film werd pas uitgebracht na The Graduate.

In 1974 keerde Hoffman terug naar de toneelplanken met zijn toneelregiedebuut All Over Town van Murray Schisgal, in 1974 had hij al zijn acteerdebuut gemaakt op Broadway in een ander stuk van Schisgal, Jimmy Shine.
Dustin Hoffman brak als acteur door in de jaren ’60, maakte begin de jaren ’80 een grote comeback en kan als een icoon in de filmwereld beschouwd worden. Ondanks zijn beperkte gestalte zag hij er qua look weinig conventioneel uit waardoor hij zich aansloot bij toppers als Barbra Streisand en Jack Nicholson waar hetzelfde van gezegd werd. In Marathon Man speelde hij een geschifte nazi-oorlogsmisdadiger, in Straw Dogs (1971) maakte hij deel uit van een walgelijke bende boerenkinkels. In de drama’s Midnight Cowboy (1969) en Little Big Man werd hij dan weer het slachtoffer van de maatschappij in het algemeen. Zeker ook het vermelden waard: zijn rol van travestiet in Tootsie (overigens ook geproduceerd door Hoffman’s eigen productiebedrijf Punch Productions), één die velen omschreven als onmogelijk te vertolken, en natuurlijk die in Kramer vs. Kramer (1979) waar hij ook al een Oscar voor kreeg. Daarin speelde hij een vader die als carrièregerichte man noodgedwongen zijn prioriteiten moest gaan bijsturen door hard te werken aan de relatie met zijn zoon wanneer zijn vrouw (Meryl Streep) hem tijdelijk verliet. Met succes, want door zijn aanpak bewees hij dat hij een betere moeder kon zijn dan een vrouw. In Tootsie (1982) leek hij dan weer te bewijzen dat hij een betere vrouw kon zijn dan een vrouw…

Zoals heel wat acteurs was Hoffman ook actief op vlak van toneel. Zijn rol van Willy Loman in de revival van het toneelstuk Death of a Salesman die hij overigens ook produceerde, vertoond op Broadway, leverde hem een Drama Desk Award op en werd verfilmd in 1985. Vier jaar later deed hij het overigens nog eens opnieuw maar dan voor televisie, hij kreeg er een Emmy Award voor waarna de film ook een tijd in de bioscoop te zien was. Lee J. Cobb was de acteur die de rol voor het eerst had gespeeld. Heel wat critici vonden Hoffman te licht als acteur, hij was volgens hen ook te jong, niettegenstaande hij tien jaar ouder was dan Cobb toen die de rol voor het eerst vertolkte op Broadway.

Met Rain Man (1988) maken we een flinke sprong in de tijd, voor zijn rol als autist in die film met Tom Cruise kreeg hij ook al een Academy Award/Oscar. Door zijn bijzondere rol werd hij vanaf dan een ster die toegankelijker werd voor filmliefhebbers in de jaren ’80. Dustin Hoffman kreeg in het verleden soms het verwijt dat hij method acting voorbij het punt van het absurde tilde. Voor een scène in Marathon Man bijvoorbeeld bleef hij dagen aan een stuk wakker, gewoon om er vermoeider uit te zien tijdens de opnames.

In 1989 en 1990 speelde hij Shylock in de Londense- (1989) en Broadway-productie van Shakespeare’s The Merchant of Venice. Hij werd voor zijn rol op Broadway genomineerd voor een Tony Award. Voor The Devil’s Arithmetic met Kirsten Dunst en Brittany Murphy was hij uitvoerend producent, de film won twee Emmy Awards. In 1997 kreeg Dustin Hoffman de Cecil B. DeMille Award.

Net zoals heel wat andere topacteurs, Robert De Niro bijvoorbeeld, was Hoffman ook te zien in een aantal foute komedies, films die niet echt aansloten bij het lijstje in zijn filmografie. Meet the Fockers (2004) bijvoorbeeld, de sequel van Meet the Parents, geregisseerd door Jay Roach, een film die vlotjes voorbij de 500 miljoen dollar opbrengst wereldwijd ging.

Dustin Hoffman heeft zijn stem ook meermaals ontleend aan een animatiefilm, zoals in Racing Stripes (2004) van Frederik Du Chau en Kung Fu Panda (2008). Voor die laatste film kreeg Hoffman de Annie Award voor Voice Acting in an Animated Feature Production. Ook in Kung Fu Panda 2 én Kung Fu Panda 3 was hij opnieuw te horen als Shifu.

In 2008 werd de acteur genomineerd voor een Golden Globe in de categorie Best Performance by an Actor in a Motion Picture – Comedy or Musical voor zijn rol in Last Chance Harvey. De film brengt een liefdesverhaal dat zich afspeelt in Londen, geregisseerd en geschreven door Joel Hopkins en met Emma Thompson als belangrijkste actrice.
In 2009 kreeg Dustin Hoffman de ere César-medaille bij de uitreiking van de Césars.

In 2012 maakte hij zijn regiedebuut in Quartet, een langspeelfilm met Maggie Smith, Tom Courtenay, Billy Connolly en Michael Gambon. De film kreeg van de National Board of Review een plaatsje in de Top Ten Independent Films van 2012. Tijdens de Hollywood Film Awards kreeg hij de onderscheiding Breakthrough Director Award, Maggie Smith werd voor haar rol genomineerd voor een Golden Globe, Billy Connolly voor een British Independent Film Award. De film bracht wereldwijd bijna 60 miljoen dollar op. Nog in 2012 werd Dustin Hoffman onderscheiden door het Kennedy Center.